質(zhì)粒最早是20世紀50年代初期在大腸桿菌中發(fā)現的，是細菌、酵母菌、放線(xiàn)菌等生物中獨立于染色體(或擬核)以外的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有自主復制能力，可在子代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。那么你知道影響質(zhì)粒構建實(shí)驗的因素有什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！
 

　　一、載體的選擇
 

　　在選取克隆載體時(shí)應留意以下幾點(diǎn)：
 

　　①具備自主復制能力，拷貝數量眾多；
 

　　②攜帶易于篩選的選擇標記；
 

　　③含有多種限制酶識別序列，以供外源基因插入；
 

　　二、引物設計留意事項
 

　　在構建質(zhì)粒時(shí)，設計引物時(shí)應考慮引物長(cháng)度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素，并避免引物間出現配對突變或次級結構等情況。
 

　　前向引物：5’端–上游克隆載體末端同源序列 + 基因正向擴增引物 --3’端
 

　　反向引物：3’端–基因反向擴增引物 + 下游克隆載體末端同源序列 --5’端
 

　　在運用PCR擴增目的基因的過(guò)程中，引物設計需留意事項：
 

　　① 引物長(cháng)度最好在18-30bp左右，常用的長(cháng)度是 20-22bp；
 

　　②引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，兩條引物間 Tm 值要保持接近，相差最好不要超過(guò) 5°C；
 

　　③GC 的含量標準通常為 40%-60% 或45-55%；
 

　　三、酶切位點(diǎn)的選擇
 

　　在構建質(zhì)粒時(shí)，選擇適當的切割酶和連接酶至關(guān)重要。對于切割酶的選擇，應該考慮到酶切位點(diǎn)的位置以及酶的反應條件等因素。而對于連接酶的選擇，則應根據所使用的質(zhì)粒載體和目標基因的大小來(lái)確定。
 

　　①選擇質(zhì)粒上兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的距離不宜過(guò)小(>10bp)，否則會(huì )影響限制性?xún)惹忻笇η悬c(diǎn)的識別，從而不利于空載體的雙重酶切。
 

　　②在克隆表達目的基因的情況下，選擇酶切位點(diǎn)時(shí)應考慮以下因素：
 

　　目標基因片段內不應含有所選酶切位點(diǎn)(否則在檢驗陽(yáng)性重組子的雙重酶切時(shí)可能會(huì )切斷目標基因)。
 

　　③在后續實(shí)驗中使用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲(chóng))盡可能含有所選的酶切位點(diǎn)，并且要確保插入載體時(shí)的方向正確(即定向克隆)，以免在更換載體進(jìn)行表達時(shí)需要重新設計引物以引入新的酶切位點(diǎn)。
 

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