細胞培養幾乎是所有細胞生物學(xué)實(shí)驗的基礎。其中，細胞傳代是將部分細胞分離出來(lái)，重新接種到新的培養皿中，使細胞重新獲得足夠的營(yíng)養條件和生長(cháng)空間的過(guò)程。對于貼壁生長(cháng)的細胞，細胞密度長(cháng)到80%-90%時(shí)，細胞狀態(tài)最好，此時(shí)可進(jìn)行細胞傳代。下面讓我們一起來(lái)看看貼壁細胞傳代的方法和注意事項吧！
 

　　一、貼壁細胞傳代（以T25瓶為例）
 

　　1.顯微鏡下觀(guān)察細胞匯合度大于80%即可傳代；
 

　　2.將移液管、移液槍、T25培養瓶、1ml槍頭、PBS溶液等放入超凈工作臺，紫外燈滅菌30min后再通風(fēng)30min；
 

　　3.培養基放置37℃水浴鍋預熱；
 

　　4.將胰酶和培養基用75%酒精消毒后放入超凈工作臺；
 

　　5.在培養箱內旋緊培養瓶瓶蓋，拿出細胞，用75%酒精消毒后放入超凈工作臺；
 

　　6.吸棄上清液；
 

　　7.用5mlPBS液潤洗細胞，吸棄PBS；
 

　　8.培養瓶加入1ml胰酶，輕輕晃動(dòng)使胰酶充分覆蓋細胞層，放入培養箱中孵育；
 

　　9.在顯微鏡下觀(guān)察細胞解離狀況，細胞明顯變圓、細胞間隙增大，輕輕晃動(dòng)可呈現流沙狀即可終止；
 

　　10.加入4ml培養基終止消化，吹打細胞層表面數次，使其分散成單個(gè)細胞；
 

　　11.收集細胞懸液到50ml離心管中，1000-1200r/min離心，3-5min去除胰酶；
 

　　12.離心管用75%酒精消毒后放入超凈工作臺，吸棄上清液，用新鮮培養基重懸細胞；
 

　　13.將細胞懸液按推薦傳代比例分裝到培養瓶，補充適量培養基，搖晃使細胞分布均勻，并做好標記；
 

　　14.在顯微鏡下觀(guān)察細胞密度及狀態(tài)，把細胞放回培養箱，旋松瓶蓋以便進(jìn)行氣體交換。
 

　　二、注意事項：
 

　　1.PBS潤洗細胞時(shí)，從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入PBS，避免沖刷到細胞層；
 

　　2.不同細胞的胰酶所需消化時(shí)間不一樣，消化時(shí)間根據細胞貼壁特性而定，可每30s觀(guān)察一次。
 

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