隨著(zhù)CAR-T治療的火熱，細胞和基因治療也進(jìn)入了白re化的狀態(tài)，細胞培養就稱(chēng)為通向CAR-T治療的第一步。貼壁細胞如何進(jìn)行傳代培養？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、所需材料

 ★  裝有貼壁細胞的培養容器

 ★  經(jīng)過(guò)組織培養處理的培養瓶、培養板或培養

 ★  wan全生長(cháng)培養基，預熱至 37℃

 ★  一次性無(wú)菌15ml試管

 ★  37 ℃培養箱，充有二氧化碳濃度為 5%的濕化空氣

 ★  平衡鹽溶液，例如: 杜爾貝科磷酸鹽緩沖液 (DPBS)，不含鈣、鎂和酚紅消化酶，例如：胰蛋百酶，不含酚紅

二、貼壁細胞傳代流程

細胞培養一定要保持工作區的無(wú)菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風(fēng)30min，操作前需要換細胞間專(zhuān)用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實(shí)驗服，戴上一次性口罩和帽子，整個(gè)無(wú)菌操作都應該在酒精燈的周?chē)M(jìn)行。

1. 取對數生長(cháng)期的貼壁細胞，棄掉舊培養基；

2. 用磷酸鹽緩沖液 (PBS)沖洗細胞1-2遍。 (每10cm²培養表面積需要2ml 溶液)。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細胞層，前后搖晃容器數次；注:沖洗步驟可去除可能抑制消化酶作用的少量血清鈣和鎂。

3. 從培養容器中吸出沖洗液并丟棄；

4. 向培養瓶中加入預熱的消化酶(例如:胰蛋白酶);試劑量應足以覆蓋細胞層(每10cm²大約0.5ml)。輕輕搖晃容器，使試劑wan全覆蓋細胞層；

5. 將培養容器在室溫下孵育約2分鐘；

請注意，實(shí)際孵育時(shí)間根據所用細胞系不同可能有所差異。

6. 在顯微鏡下觀(guān)察細胞解離情況。如果解離程度未達90%，可將孵育時(shí)間延長(cháng)幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養容器以加快細胞解離。

7. 細胞解離程度大于等于90%時(shí)，傾斜培養容器，使細胞上液體盡快流盡。加入所用消化酶兩倍體積的預熱wan全生長(cháng)培養基。輕柔吹打細胞層表面數次，使細胞分散成為單細胞懸液。

8. 將細胞轉移到15ml離心管中，200g 離心5至10分鐘。

請注意：離心速度和時(shí)間依細胞種類(lèi)不同而有所差異。

9. 用最少體積的預熱wan全生長(cháng)培養基重新懸浮細胞沉淀。

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