原代細胞(primary cell)：是指從機體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個(gè)細胞并在體外進(jìn)行模擬機體培養的細胞，稱(chēng)為原代細胞。一般認為，培養的原代的第1代細胞和傳代到第10代以?xún)鹊募毎y稱(chēng)為原代細胞培養。

原代細胞的獲取難度大、需要考慮的問(wèn)題多，原代細胞如何獲取？

原代細胞的獲取，就是從活體上將組織分解成單個(gè)細胞再進(jìn)行培養的過(guò)程，且整個(gè)過(guò)程要求無(wú)菌操作。具體要考慮的問(wèn)題有：組織分解的方式，培養的時(shí)間，換液時(shí)間，細胞狀態(tài)判斷和凍存。

一、組織分解的方式

將組織分解成單個(gè)細胞的方式目前主要有兩種：酶消化法和組織塊法（針對貼壁細胞）。

1. 酶消化法：所用試劑：膠原酶和胰酶。

 膠原酶的選擇：（根據自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實(shí)驗成功的大前提。）

膠原酶的配制：常用的是DMEM進(jìn)行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內預熱（注意現用現配）。

膠原酶消化時(shí)間：根據組織特性，消化時(shí)間會(huì )有差異。以小鼠腎細胞為例，加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后，放入37℃培養箱中消化45min~1h左右，期間每隔10min中震蕩一次，知道組織塊幾乎wan全消失為止（若是組織塊剪得非常細小，時(shí)間可以短一些，30min左右即可）。

培養過(guò)程：注意原代細胞在培養2天后可能會(huì )出現細胞液變黃（橘黃色）的現象，且無(wú)漂浮物，這是正常現象哦，不是污染。這是由于細胞在貼壁生長(cháng)過(guò)程中釋放了CO2和其他物質(zhì)導致培養液PH發(fā)生了改變，所以變黃。

2. 組織塊法

取材：取組織中間部位，剪成大小均勻的小方塊（1~4mm²），清洗干凈后轉移至培養皿中，在培養皿中各組織塊要排列均勻。 

加液：培養液不能浸沒(méi)組織塊，避免組織漂浮。然后培養4h左右加培養液，培養48h后換液。

二、培養時(shí)間

無(wú)論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養時(shí)間最少需要一周以上的時(shí)間，期間可換液或者傳代。

三、換液時(shí)間

無(wú)論酶消化法還是組織塊法，在培養期間需要隨時(shí)關(guān)注細胞的生長(cháng)狀況，需觀(guān)察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀(guān)察是否有細胞遷移出來(lái)。正常情況下48~72h可換液一次。

四、細胞狀態(tài)判斷

正常貼壁細胞在培養幾天后，會(huì )逐漸貼滿(mǎn)整個(gè)瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。這些細胞的狀態(tài)比較好，生長(cháng)至80%~90%融合就可以傳代啦，傳代一次后的細胞會(huì )更干凈漂亮。

五、凍存

傳一代后的細胞（也可以不傳代直接凍存）培養至80%~90%便可凍存起來(lái)供后續實(shí)驗用。

凍存液配制：不同的細胞可能會(huì )有不同的凍存液配制方案，各實(shí)驗室也有自己的凍存方案，

常見(jiàn)的方案有：

a: 10%DMSO+90%的FBS；

b: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM；

c: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS 。

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