上文介紹了流式細胞術(shù)的原理及應用，今天讓我們學(xué)習一下怎么用流式細胞儀分選T細胞吧~

一、樣本制備

1.取樣: 取100μL抗凝血。

2.標記：根據抗體說(shuō)明書(shū)標記實(shí)驗管。混勻后，室溫避光孵育15分鐘。

3. 溶血：將10×裂紅液用水稀釋10倍，每管加入1mL，振蕩器混勻后室溫避光靜置10分鐘，300g，4°C離心5分鐘。

4. 洗滌：棄去上清，加入1mL 1×PBS洗液，300g離心洗滌5分鐘，洗2-3次。

5. 上機檢測：棄去上清后加入500μL 1×PBS，混勻懸浮后過(guò)濾，避光等待上機檢測。

二、儀器操作

1. 打開(kāi)流式細胞儀、開(kāi)啟液流、質(zhì)控。

2. 分選前設置：共包含兩個(gè)步驟，第一，調節合適的液流斷點(diǎn)，待四路窗口形成清晰的5路液流，其中含4個(gè)收集液流，一個(gè)廢液流后，利用“sweetspot"鎖住此斷點(diǎn)；然后利用Accudrop 珠子，調整 “Drop Delay"時(shí)間，當左側液流接近 100%，而且保持相對穩定的范圍的時(shí)間是最佳時(shí)間。

3. 設置分析條件：完成質(zhì)控后，建立用戶(hù)文件夾、當日實(shí)驗文件夾，根據細胞標記，選擇所需參數，根據各抗原之間生物關(guān)系及實(shí)驗主要關(guān)注點(diǎn)，畫(huà)好 FSC-SSC及各熒光參數兩兩相對的散點(diǎn)圖，根據抗原生物關(guān)系設置分析門(mén)，及群級聯(lián)關(guān)系表。

4. 確定電壓：先上對照管，根據淋巴細胞在 FSC-SSC散點(diǎn)圖中的位置，調整 FSC和SSC兩個(gè)參數的電壓，保證淋巴、單核及中心粒細胞呈現在合適的位置，然后設置P1 門(mén)圈住淋巴細胞；根據陰性細胞群位置，調整好其它熒光參數的電壓，記錄10000個(gè)細胞。

5. 分類(lèi)計數：上陽(yáng)性管，通過(guò)分級設門(mén)，完成各抗原之間生物關(guān)系的呈現，及各細胞分類(lèi)計數情況。

6. 分選設置：在“sort layout"窗口，設置收集裝置和純度模式，然后設置分選門(mén)，圈住CD4或CD8 陽(yáng)性的細胞，將分選門(mén)分別填入左右“sort location field" 框中。

7. 分選：將收集管中分別裝200ul 1XPBS，放入儀器分選倉下面的收集管架上：點(diǎn)“sort"開(kāi)始分選，此時(shí)“sort location field"框中可見(jiàn)所獲得的CD4或CD8陽(yáng)性的細胞數目；收集到足夠的目的細胞后，停止分選。

8.細胞純度檢測：利用上樣針清洗液和水清洗上樣針，直到以水上樣時(shí)，FSC-SSC散點(diǎn)圖中“無(wú)點(diǎn)"為止。將分選獲得的CD4陽(yáng)性細胞上樣回測，觀(guān)察細胞分選純度；再次清洗上樣針，將分選獲得CD8陽(yáng)性細胞上樣回測，觀(guān)察細胞分選純度。

通過(guò)以上實(shí)驗步驟，我們可以成功分選并收集到特定的T細胞群體。

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