PCR嵌合體(Chimeric Products)：PCR擴增反應中的嵌合體是指一個(gè)PCR產(chǎn)物來(lái)自?xún)蓚€(gè)或多個(gè)模板分子，通常是由于延伸未完quan導致的?。這種現象通常發(fā)生在PCR反應中，特別是當使用多重PCR或復雜模板時(shí)。嵌合體會(huì )導致擴增產(chǎn)物中含有非預期的片段，有可能會(huì )影響實(shí)驗結果的準確性，甚至導致錯誤的解釋。

在PCR反應中，DNA模板在高溫下解旋成單鏈，然后在低溫下引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合。當DNA聚合酶在延伸階段未能wanquan復制某個(gè)序列時(shí)，該部分序列在下一輪PCR反應中作為引物繼續延伸，從而與其他序列混合，形成嵌合體序列?。具體來(lái)說(shuō)，DNA聚合酶在擴增某一片段時(shí)，可能會(huì )在模板鏈的某個(gè)位置發(fā)生“跳躍"，將一個(gè)模板DNA片段與另一個(gè)模板片段拼接，從而生成嵌合體產(chǎn)物。嵌合體可以通過(guò)多種機制形成，但大多數嵌合體被認為是由于擴增不完整而引起的

常見(jiàn)的情況有以下三種：

在PCR中，如果存在多個(gè)不同的模板DNA，它們的片段可能在擴增過(guò)程中偶然地組合在一起。具

引物二聚體是引物分子自我結合形成的二聚體。如果PCR引物設計不當，或者引物濃度過(guò)高，可能會(huì )導致引物二聚體的產(chǎn)生，這些二聚體可能會(huì )參與擴增過(guò)程，導致非特異性的擴增。在某些情況下，DNA聚合酶在復制錯誤的引物二聚體或非特異性產(chǎn)物時(shí)，也可能會(huì )形成嵌合體。

DNA聚合酶在延伸過(guò)程中，有時(shí)會(huì )發(fā)生“跳躍"或“滑移"，從一個(gè)模板區域轉移到另一個(gè)模板區域，這種現象通常發(fā)生在復雜的、含有重復序列或相似序列的區域。例如，如果模板中存在相似的序列(常見(jiàn)的擴增子測序)，聚合酶可能會(huì )錯誤地“切換"到另一條模板鏈，導致不同片段的連接，從而產(chǎn)生嵌合體。

總結：

通常在PCR過(guò)程中，大概有1%的幾率會(huì )出現嵌合體序列，而以在16S/18S/ITS 擴增子測序的分析中，系統相似度很高，當擴增相似序列時(shí)，嵌合體可達1%-20%，需要去除嵌合體序列。

嵌合體的比例與PCR循環(huán)數相關(guān)，循環(huán)數越高，嵌合體比例越高。

• 使用純凈、單一來(lái)源的模板，避免多重模板

• 優(yōu)化引物設計，確保引物特異性，避免引物二聚體產(chǎn)生

• 降低PCR反應溫度和優(yōu)化擴增條件

• 減少PCR循環(huán)次數

• 使用高保真(High-Fidelity)DNA聚合酶

• 使用有限的DNA模版量

怎么判斷你的PCR產(chǎn)物中有沒(méi)有嵌合體呢？可以使用以下方法進(jìn)行檢測：

凝膠電泳：通過(guò)凝膠電泳查看PCR產(chǎn)物的大小和模式，若出現多個(gè)不一致的條帶或意外的遷移模式，可能意味著(zhù)嵌合體的存在。

測序：對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序。通過(guò)對比測序結果與預期的目標序列，可以檢測到嵌合體的存在，并分析嵌合體的組成。

限制性酶切分析：如果知道嵌合體的可能位置，可以使用限制性?xún)惹忻?/span>切割PCR產(chǎn)物，分析切割結果是否符合預期。（如需凝膠電泳產(chǎn)品，NEB PaqCI限制性?xún)惹?/a>酶、測序試劑盒，請聯(lián)系天津益元利康生物科技有限公司）